کاربردهای PCR:

1- جداسازی DNA : با این روش میتوان قطعه ای از DNA را از ژنوم استخراج نمود و در روشهایی مثل روشهای بلاتینگ به منظور تولید پروب  و همچنین در روشهای کلونینگ و نیز به منظور تعیین توالی DNA یک نوع سلول استفاده نمود. همچنین از DNA استخراج شده میتوان در موارد پزشکی قانونی برای تعیین هویت استفاده نمود. ( تهییه اثر انگشت DNA‌)

2- تکثیر و  تعیین مقدار DNA: با  روش  PCR میتوان مقادیر بسایر اندک موجود در هر نمونه ای را تکثیر نمود و مورد بررسی قرار دا که این روش به خصوص در مواردی مانند بررسی DNA اندک موجود در فسیل ها و حیوانات قدیمی و به عبارتی در تحقیقات باستانشناسی حائز اهمیت میباشد. همچنین به کمک روشی از PCR تحت عنوان Real-Time PCR میتوان مقدار دقیق DNA موجود در نمونه را بررسی نمود که این روش  کمی از PCR به خصوص در مورد عفونتهایی مانند ایدز که نیاز به بررسی Virus Load دارند بسیار مفید میباشد.

3- کاربرد در پزشکی: PCR به عنوان یک روش بسار مناسب در بررسی اولیه بیماریهای بدخیم مانند لینفوما ها و لیپوم ها و به ویژه بررسی جابه جایی های کروموزومی بسیار ارزشمند میباشد. همچنین PCR روشی مناسب در بررسی بسیاری از میکرو ارگانیسم های سخت رشد مانند مایکوباکتری ها، باکتری های بی هوازی و ویروسها میباشد. از روش کمی PCR نیز (RT-PCR) در اندازه گیری میزان ویروس در بدن میتوان استفاده نمود.

روش PCR بر روی 200-10 میکرولیتر نمونه که در تیوب هایی کوچک ریخته شده و در دستگاه قرار داده میشود انجام میشود.

سیکل کامل PCR شامل چندین مرحله همراه با تغییرات دمایی میباشد که به ترتیب این مراحل به صورت زیر میباشد:

1- مرحله ابتدایی یا آغاز گر: این مرحله، مرحله ابتدایی به منظور فعالسازی آنزیم DNA Polymerase میباشد که در این مرحله دما به حدود 96-94 درجه سانتیگراد در مدت 9-1 دقیقه میرسد. 

2-Denaturaion Step ( مرحله دناتوراسیون): این مرحله به مدت 30-20 ثانیه در دمای 96-94 درجه سانتیگراد میباشد که باعث شکسته شدن پیوندهای هیدروژنی بین 2 رشته DNA و در نتیجه جدا شدن 2 زنجیره از یکدیگر میشود.

3-Annelieng step : در این مرحله دما به 65-50 ( 3-2 درجه پایین تر از دمای ذوب پرایمر میباشد)درجه سانتیگراد کاهش میابد و این دما به مدت 40-20 ثانیه بر سیستم حاکم میباشد. در اینم مرحله پرایمر مورد استفاده با تک رشته های DNA باند شده و توسط آنزیم پلی مراز سنتز DNA آغاز میشود. پرایمر مورد استفاده از نظر توالی لازم است که کاملا به تک رشته DNA مورد نظر جفت شود بنابراین توالی DNA مورد نظر از قبل باید شناسایی شده باشد.

4- مرحله طویل سازی: در این مرحله مجددا دما افزایش یافته و به حدود 72 درجه سانتیگراد میرسد البته این دما بستگی به نوع آنزیم دارد که برای Taq Polymerase حدود 80-75 میباشد که اغلب در حدود 72 درجه استفاده میشود. در این مرحله آنزیم پلی مراز دزوکسی نوکلئوزید تری فسفات ها dNTP را در جهت 5 به 3 اضافه میکند و رشته جدید را سنتز میکند. زمان مورد نیاز بسته به نوع آنزیم مورد استفاده و طول DNA مورد نظر متفاوت میباشد. معمولا آنزیم پلی مراز اغلب قدرت اضافه کردن 1000 باز را در هر دقیقه دارد.

5- مرحله نهایی طویل سازی: این مرحله به مدت 15-5 دقیقه در دمای 74-70 به منظور اطمینان توسعه همه بقایای DNA تک رشته ای صورت میگیرد.

6- مرحله آنالیز: در این مرحه محصولات PCR به ژل آگارز آکریل آمید انتقال داده شده و تحت تاثیر جریان الکتروفورز قطعات بر اساس وزن مولکولی از یکدیگر جدا شده و در نهایت با استفاده از یک DNA رهبر یا الگو که حاوی  قطعاتی با وزن مولکولی مشخص میباشند محصولات جدا شده شناسایی میشوند.

Figure 3: Ethidium bromide-stained PCR products after gel electrophoresis. Two sets of primers were used to amplify a target sequence from three different tissue samples. No amplification is present in sample #1; DNA bands in sample #2 and #3 indicate successful amplification of the target sequence. The gel also shows a positive control, and a DNA ladder containing DNA fragments of defined length for sizing the bands in the experimental PCRs.

Polymerase Chain Reaction که به اختصار PCR نامیده میشود روشی  پر کاربرد در حیطه مولکولی میباشد که با استفاده از آنزیم DNA پلی مراز اقدام به تکثیر و تولید میلیونها نسخه DNA  از میزان کمی از این ماده میکند. این روش روشی پر کاربرد و پر استفاده در حیطه تشخیص بسیاری از بیماریها، پزشکی قانونی و بسیاری از دستکاریهای ژنتیکی میباشد. اساس این روش بر پایه یک سیکل حرارتی و تغییرات دمایی است بنابراین لازم است از آنزیمهایی که مقاوم در برابر حرارت هستند استفاده نمود مانند Taq Polymerase که از گونه ای از باکتری به نام Thermus aquaticus به دست میاید. برای انجام روش PCR نیاز است که توالی قطعه DNA مورد هدف از قبل شناسایی شده باشد تا بتوان پرایمر مناسب را جهت همانند سازی و آغاز تکثیر طراحی نمود. در اغلب تکنیکها نیز حداکثر وزن قطعه مورد هدف باید 10Kbp باشد البته تکنیکهایی با قدرت تکثیر قطعات بزرگتر تا 40Kbp نیز وجود دارد.

اجزا مورد نیاز: شامل

1- DNA الگو  که قرار است تکثیر شود.

2- آنزیم پلی مراز مناسب

3- داکسینوکئوزیدتریفسفات dNTP

4-کاتیونهای 2 ظرفیتی که عمدتا Ca کلسیم استفاده میشود. منگنز Mn نیز به عنوان یه عامل موتاژن در مواقع نیاز استفاده میشود. و کاتیونهای تک ظرفیتی مانند پتاسیم.

5- بافر که ایجاد یک محیط شیمیایی مناسب را برای انجام عملیات میکند.

۶- پرایمر: قطعه از RNA که برای آغاز همانند سازی و شروع به کار DNA پلیمراز لازم است.

روش انجام PCR را در پست بعدی آماده میکنم.

دیستروفی های ماهیچه ای نوعی ناهنجاری در ماهیچه ها بوده که با تحلیل و ضعف عضلانی همراه بوده و در فاز های انتهایی بیماری جایگزینی بافت پیوندی و چربی را به جای فیبرهای عضلانی به همراه دارد. این ناهنجاریها عضلات ار گانهایی ...

دانشمندان براي اولين بار از تكنيك ژن درماني براي اصلاح ديد در بيماراني كه مبتلا به نوع نادري از كم بينايي پيشرفته مي باشند، استفاده كردند. آزمايشات بر روي ۴ نفر از ۶ بيمار جواني كه تحت درمان قرار گرفتند، نتيجه مثبت داد. دو نفر از داوطلبان كه تنها قادر به ديدن حركات دست بودند، توانستند بعد